HPLC流動(dòng)相的注意事項(xiàng)
作者：admin 內(nèi)容來源：本站原創(chuàng) 發(fā)布時(shí)間：2016年04月26日 瀏覽量：
流動(dòng)相具有運(yùn)載樣品分子的作用。
流動(dòng)相還具有選擇性分離的作用。
當(dāng)固定相一定時(shí)，流動(dòng)相的種類、配比和流動(dòng)速度都嚴(yán)重影響分離效果。
>> 流動(dòng)相的作用
流動(dòng)相具有運(yùn)載樣品分子的作用。
流動(dòng)相還具有選擇性分離的作用。
當(dāng)固定相一定時(shí)，流動(dòng)相的種類、配比和流動(dòng)速度都嚴(yán)重影響分離效果。
>> 流動(dòng)相的種類
液相色譜所用流動(dòng)相根據(jù)分析目的可分為單一或混合流動(dòng)相。
混合流動(dòng)相還可分為比例固定和比例可變流動(dòng)相。
梯度洗脫就是使用比例可變流動(dòng)相。
>> 流動(dòng)相使用的注意事項(xiàng)
流動(dòng)相的級(jí)別
流動(dòng)相的處理
——過濾和脫氣
流動(dòng)相的置換
>> 流動(dòng)相的級(jí)別-水
水是最常見的極性溶劑
HPLC用水的要求：純化水（重蒸水）
因?yàn)椴患兾锏拇嬖冢ルx子水的吸光率較高。
純化水中去除了無機(jī)和有機(jī)的污染物，因此吸光率降低。
>> 流動(dòng)相的級(jí)別-有機(jī)試劑
采用“HPLC”級(jí)溶劑
溶劑級(jí)別
–HPLC級(jí)
–優(yōu)級(jí)純
–分析純
1、都經(jīng)過蒸餾和0.45um濾膜的過濾(除纖維毛、未溶解的機(jī)械顆粒等）。
2、優(yōu)級(jí)純的純度比分析純大,但里面含有極微量的防腐劑和抗氧化劑，這些添加劑往往有紫外吸收。
3、HPLC級(jí)經(jīng)過0.2um濾膜的過濾,且除去有紫外吸收的雜質(zhì)。
>> 分析純級(jí)和HPLC級(jí)溶劑的吸光度比較圖
>> 流動(dòng)相的處理——過濾
•使用0.45um或更小孔徑濾膜過濾，注意濾膜的種類。
•目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞管路和色譜柱，尤其是使用無機(jī)鹽配制的緩沖液時(shí)。
>> 濾膜類型
1、聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽。
2、醋酸纖維濾膜：不適用于有機(jī)溶劑，特別適用于水基溶劑。
3、尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑和水溶液，可以用于強(qiáng)酸，不適用于二甲基甲酰胺。
4、再生纖維素濾膜：蛋白吸收低，同樣適用于水溶性樣品和有機(jī)溶劑。
>> 過濾的注意事項(xiàng)
•不同的試劑分別過濾，過濾后再混合。
•注意濾膜的選擇，不要混用。
•要現(xiàn)用現(xiàn)處理，尤其是水和緩沖液。
•要注意操作過程中的防塵。
•試樣也必須過濾，可用一次性針頭式過濾器。
>> 流動(dòng)相的處理——脫氣
•目的：除去流動(dòng)相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡。
•使用梯度洗脫時(shí)要有在線脫氣裝置。
•氣泡對測定的影響：
1、造成壓力波動(dòng)，影響保留時(shí)間。
2、色譜柱中的氣泡會(huì)造成峰變形。
3、檢測池中的氣泡會(huì)造成基線波動(dòng)。
>> 脫氣的方法
•1、超聲波振蕩脫氣
•2、氦氣置換清除法
•3、使用樹脂膜的減壓脫氣法
•應(yīng)根據(jù)實(shí)際的使用情況選擇合適的脫氣方法。單一流動(dòng)相或配合好的混合流動(dòng)相可以采用超聲振蕩脫氣，梯度洗脫最好使用在線減壓脫氣。
>> 氦氣置換清除法
>> 使用樹脂膜的減壓脫氣法
>> 流動(dòng)相的置換
•極性相似的試劑可以直接置換。
•極性不同的試劑，應(yīng)用中間試劑作過渡。
例如：甲醇置換為正己烷時(shí)，可以考慮選擇異丙醇作為中間試劑。
•緩沖液的置換應(yīng)先用水沖洗，再用有機(jī)試劑置換水。直接使用有機(jī)試劑會(huì)造成鹽的結(jié)晶，堵塞管路和色譜柱。
